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【CEM MultiPep】SPOT 合成的質量控制

 更新時間:2024-04-08 點擊量:242

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什么是SPOT合成?

What is SPOT synthesis?

SPOT 方法由 Ronald Frank 開發,用于在均質膜載體上的不同位點同時合成多肽。該技術的原理是將預活化的氨基酸衍生物的小液滴分配到多孔膜上預定義的位置陣列上。液滴被吸收并形成單獨的反應室,用于固相合成中的化學反應。大量不同的點可以排列在一張膜上,并且這些點中的每一個都可以通過相應試劑溶液的手動或自動輸送來單獨處理。每個區域的點數和點大小由膜的吸收能力和液滴的體積決定。根據基質的特定功能,點大小與合成的特定規模相關。 Ronald Frank 最初使用的濾膜仍然是蕞受歡迎的載體,由改性纖維素濾紙制成。


在 MultiPep 1&2 合成器上合成肽陣列是一種創建大量肽的廉價且方便的方法。它們通過活化氨基酸液滴的沉積在纖維素膜支持物上合成。與之前相比,膜和氨基功能之間的鍵合在穩定性上得到了改善。它現在對 100% 三氟乙酉夋穩定,并且在堿性條件下進行試驗不會導致肽損失。該鍵不能被切割以釋放肽。肽保持共價連接,因此難以進行質量控制。有幾種方法可以獲取有關合成質量的信息。

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合成與表位分析

Synthesize and analyze some epitopes

您可以制造一些您知道在以前的項目中起作用的肽,但這也需要您掌握一些抗體。一種更簡單的方法是制作鏈霉親和素識別的 Strep-tag。然后可以使用通用的鏈霉親和素報告偶聯物進行檢測。通過截短表位可以實現不同的信號強度或親和力。Strep-tag II 的完整序列是:NWSHPQFEK,并且可以檢測到埋在另一個序列中的 HPQ 核心。

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耦合報告分子

Couple a reporter molecule

通常在每個合成周期中都有一個乙?;襟E,該步驟應封頂所有未反應的鏈。如果出現嚴重的合成問題,在后面的合成步驟中就會出現完荃的封頂,而不會留下任何游離的氨基。因此,N端的報告分子將表明大部分合成是正常的。有用的報告分子有

  • 生物素,用簡單的普通鏈霉親和素-報告基因共軛物檢測

  • 鏈霉親和素報告共軛物也能檢測到 N 端的鏈霉標簽II(NWSHPQFEK)。

  • 羅丹明染料,像氨基酸一樣容易耦合,在日光條件下可見

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在合成過程中進行一些檢查

Perform some checks during synthesis

手冊中介紹了在合成過程中觀察游離氨基的溴酚染色步驟。簡而言之,在溶液中沒有堿的情況下用溴酚藍在 DMF 中的極稀釋溶液(1% 溶液,1:100 稀釋)對膜進行染色。斑點應顯示為淡藍色,其強度隨序列而變化??蓪⒈∧び坝?,以詠久記錄一些相關的合成步驟。您還可以使用手持式紫外燈來觀察合成后的肽。特別是色氨酸序列在這種紫外燈下會發光。這種紫外燈很容易買到而且價格便宜。通常由礦物學家使用或用于驗鈔。

上圖為煙草在 LUYOR-3410 紫外線燈照射下觀察到的效果

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分析一些參考肽

Analyze some reference peptides

您可以切出單個斑點,對其進行氨基酸分析。更好、信息量更大的質控方法是 MALDI 分析。讓一些肽在 C 端以 Lys-Gly 結尾。在完荃側鏈脫保護后切下斑點,用胰蛋白酶去除肽。這樣得到的溶液中即使只有百分之幾的肽被釋放出來,也足以進行 MALDI分析。請注意,如果存在其他 Lys或 Arg 殘基,肽也會在內部被切斷。如果在第一個循環中引入一個可裂解的連接體(如 Rink 酰胺連接體),則整個肽都可以用反式脂肪酸釋放出來。在這種情況下,必須在側鏈脫保護之前將點切割出來并單獨處理。釋放的量也足以用于 HPLC 操作。

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一般性評論

General remarks

SPOT 合成的最佳肽段長度為 10 到 25 個殘基。超過這個長度后,質量就會慢慢下降,因為并非所有的肽鏈都能完荃進入。正如 RudolfVolkmer 小組的詳細分析所示,纖維外側較容易獲得的肽鏈甚至可以增長到 50 個殘基的長度。在這種情況下,通過 Fmoc-和 Boc-beta- 丙氨酸混合物的耦合,膜的初始負載量至少應減少 10-100 倍。肽的原始負載量通常比抗體結合所需的負載量高出幾個數量級,甚至只有很少的正確序列能被檢測到。因此,在每個合成步驟中采用良好的封端程序,并通過軟件引導的機器人進行可靠的氨基酸分配,在 N 端使用報告染料就可以對合成程序進行簡單的驗證,讓人放心。

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使用林克酰胺連接劑進行 SPOT 合成的質量控制

QC on SPOT synthesis using a Rink amide linker

在 MultiPep 1&2 合成器上合成肽陣列是一種廉價而方便的大量合成肽的方法。它們是通過沉積活化氨基酸液滴在纖維素膜支架上合成的。與第一份出版物相比,膜與第一個耦合氨基酸功能之間的結合穩定性有所提高?,F在,它對 100% 的反式脂肪酸都很穩定,在堿性條件下進行檢測也不會導致肽的損失。這種鍵不能被裂解以釋放肽,而是保持共價連接,因此很難進行質量控制。如果在第一個循環中引入了可裂解連接體(如 Rink 酰胺連接體),則整個肽都可以用反式

脂肪酸釋放出來。在這種情況下,必須在側鏈脫保護之前切出該點并單獨處理。


建議程序:

    1. 根據儀器手冊設置合成。

    2. 在合成的第一個循環中,將 FMOC-Rink 酰胺連接物引入所需的質控肽。***質控肽可在膜角附近合成,以便于去除。

    3. 合成后,從儀器上取下干燥的膜并觀察斑點

  • 使用手持式紫外線燈最容易做到這一點。然后用鉛筆圈出質控點,再從膜上剪下。

  • 或者,為了使斑點顯現出來,可將膜浸泡在 DMF 溶液中的1% 溴酚藍中。斑點應呈現淡藍色,其強度隨序列而變化。

    4. 將切下的質控點放入 1.5 mL 螺旋蓋微量離心管(或類似試管)中,加入 150 uL 通用裂解混合物(或自選混合物)。蓋緊試管蓋,培養 2-4小時。這將使肽從各自的林克酰胺連接體上裂解,并去除側鏈保護基團。

    5. 將含有已裂解多肽的上清液轉移到一個新的微量離心管中,并丟棄裝有已用斑點的離心管。

    6. 使用標準實驗室程序將溶液完荃干燥(應注意強酸和實驗室設備)。

    7. 用 10 uL 0.1 % 的反式脂肪酸重溶干肽。

    8. 對該溶液進行 MALDI分析,基質一般為1μL 或更少。(注意 MW為 -1)

注:三氟乙酉夋(TFA)是一種揮發性很強的酸。整個裂解和加工過程必須在通風櫥中進行。在此階段必須佩戴安全眼鏡、手套和白大褂,并遵守所有安全規定。所有廢物必須按照國家規定進行處理。


通用裂解混合物

  • 92.5%(vv)三氟乙,TFA

  • 5% (v/v) 三異丙基硅烷

  • 2.5% (vv) 水

用于可裂解點的 Fmoc 鏈接器

Su et al.

Epigenetics&Chromatin volume 7, Article number:7(2014),組合 PTM 組蛋白肽微陣列合成使用 RespepSL 自動合成器(Intavis AG,KoIn,Germany,MultiPep 1CEM)在改性纖維素上合成肽。將Fmoc從 celluspot 中移除并耦合 Cy3(Lumiprobe,公司)后,就得到了纖維素-Cy3 染料共軛的斑點對照??瞻准毎邔φ战M是通過去除色斑上的 Fmoc 并將試紙置于溶解條件下而制成的。對于肽,初始偶聯包括等摩爾量的Fmoc-Ala-OH 和 Boc-Ala-OH,以減少樹脂負載并提高合成質量。每次合成的肽都含有可被酸裂解的鏈節,以便通過高效液相色譜法和質譜法進行質量評估(附加文件 12:表 S2)。此外還加入了 20 原子的聚乙烯連接體(PE)(Novabiochem 公司),以提高合成效果和陣列中的蛋白質結合力。Fmoc-Glu-(biotinyLPEG)-OH(Novabiochem)是鏈霉親和素的對照。

使用標準的 Fmoc/tBu 化學方法生成 13 氨基酸肽。如前文所述 [24],肽的 PTM 以適當保護的單體形式引入。合成完成后,用 82.5% 的三氣乙酸(TFA)去除側鏈保護基團:5% 硫代苯甲醚5% 水:5%二氯甲烷中的飽和苯酚:2.5%乙烷二硫醇,持續 90 分鐘(每個點150μ)。取出溶液,換上 250 μ的 88.5% 反式脂肪酸、4% 三氟甲磺酸、2.5% 三異丙基硅烷和 5% 水,輕輕攪拌過夜以溶解纖維素。用冷的二乙酉迷沉淀肽纖維素共軛物兩次,晾干幾分鐘,然后重新溶解到100μ 的二甲基亞砜(DMSO)中。


Boisguerin et al.

Chemistry & Biology, Vol. 11, 449–459, April, 2004,我們用與 PSD-95 PDZ3-結構域結合的多肽 NYKQTSVCOOH 測試了硫醚環化的效率[148]。溴乙?;?10)(粗體數字 10-12 參考圖 3.5 (A))是在幾個可裂解點上合成的(通過加入Fmoc-Rink 連接器實現可裂解性)。3 小時后,用反式脂肪酸將肽產物 h-1、h-2 和 h-3 從點上裂解,并用 HPLC 和 ESI-MS 進行分析(圖 3.5 (B))。對反應產物的分析清楚地表明,在 h-3 條件下,硫醚-環化反應的效率很高。為了確定肽序列對環化!清除步驟的影響,我們又合成了兩種膜結合溴乙?;?EFHAALGSYVCOOH和 QHIDSQKKACOOH。


關于點合成的常見問題

1. SPOT 合成的時間是什么時候?

使用雙偶聯方案合成 4x384 肽時,每個周期需要 2 個小時,最后處理需要 2-3 個小時。每個周期的操作時間約為 30 分鐘,用于制備活性衍生物和清洗膜。

2. 膜上肽的密度是多少?

標準密度為 10x15 厘米纖維素膜片上 600 個肽網格,中心到中心的距離為 4.2 毫米。也可以自由定義其他網格。在非常受控的條件下,纖維素膜上的密度可達 25x40 個點。

3. 一個點有多少肽?

我們提供的膜經過衍生處理后,游離氨基的負載量約為 300-400 nmol/cm2。每個斑點的負載量可通過面積計算得出。

例如:一個直徑為6毫米的點約有 80 納摩爾的肽,一個直徑為3 毫米的點約有 20 納摩爾的肽。

4. 在 CelluSpots 合成過程中,應選擇哪種品牌的濾紙放在框架下?

建議使用 Whatman 540 或 541

5. 乙?;嚢彼崛绾斡糜诤铣?

獲取 Fmoc-LyS(Ac)-OH,CAS#159766-56-0,并按照與 MultiPep 1&2 相同的標準偶聯方法進行偶聯。

6. Ahx連接劑的親水性對應物是什么?

建議使用 Fmoc-8-氨基-3,6-二氧雜辛酸。

7. 如何提高小規模濾板合成的產量?

使用 Ramage 樹脂(PC-01-0601),用小容量裂解雞尾酒可立即裂解肽。

8. 如何使用 MultiPepRSi 或 RespepSL 合成 PNA 使用以下設置:

PNA 單體:0.3M 在 NMP 中使用新型偶聯劑

活化劑:HATU 或 PyAOP(0.6M 溶液);HATU 更穩定,PyAOP 應每天更新。

堿混合物:DIPEAV2,6-lutidine(1.2/1.8M,DMF 中),兩種堿在 DMF 中的混合比例為20.09%(vvv)。

9. 如何減少消旋化?

在所有合成的肽中,外消旋化約占 1%。消旋化會使肽更加穩定,從而導致錯誤折疊。苯丙氨酸和組氨酸會發生消旋化。組氨酸在 50C 或更高的溫度下很容易發生消旋化。DIC 和 OxymaPure 的組合可減少消旋化。PyOxim 和 NMM 的組合更易發生消旋化,但不如 HBTU 和 NMM 的組合。

10. 如何減少脫保護過程中天冬氨酸的形成?

在整個合成過程中,用 20% 的哌啶在 DMF(含 0.1M HCOOH)中對 Fmoc 基團進行脫保護,以避免天冬酰亞胺副反應。

11. 如何從 SPOT 膜上裂解多肽?

使用 Fmoc 鏈接劑作為第一個氨基酸。切出所需的點并涂上裂解液。Rink-Linker 會自行裂解并生成 C 端酰胺。

12. 我的 SPOT 肽中有一部分 N 端酰胺被乙?;?。如何避免這種情況?

最后一個氨基酸使用叔丁氧羰基氨基酸。這樣可以避免濾紙和濾紙下方通道中的微量醋酸酐造成乙?;?。

13. 溶解了 NMP 的氨基酸可以保存多久?

除半胱氨酸和蛋氨酸外,氨基酸溶液可在 4℃ 下保存一個月。請注意,如果粉未變質,丙氨酸和谷氨酸會產生沉淀。

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